産総研、鋳型なしでＲＮＡを合成する特殊なＲＮＡ合成酵素の反応機構を解明
■鋳型なしＲＮＡ合成酵素の３０年来の謎を解明
－新たなＲＮＡ合成酵素・機能性タンパク質開発技術に道を開く－
●ポイント
・長年謎であった鋳型なしでＲＮＡを合成する酵素の反応過程を一連のＸ線結晶構造解析で解明した。
・ＲＮＡ合成酵素とＲＮＡ鎖とＲＮＡ塩基単量体三者の協同的作用によって酵素の構造が劇的に変わりＲＮＡ合成反応が進行していることが明らかになった。
・ＤＮＡ／ＲＮＡ等の鋳型なしでＲＮＡを合成する酵素の開発や機能性タンパク質の開発に期待。
概要
独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 吉川 弘之】（以下「産総研」という）生物機能工学研究部門【部門長 巌倉 正寛】の富田 耕造 研究グループ長と独立行政法人 科学技術振興機構【理事長 沖村 憲樹】の濡木 理 研究員（東京工業大学 教授）らは鋳型なしでＲＮＡを合成する特殊なＲＮＡ合成酵素の反応機構の全貌を明らかにした。
細胞内でタンパク質が合成される際、アミノ酸を運んでくるｔＲＮＡという７０－９０塩基のＲＮＡ１本鎖があり、このＲＮＡ鎖の大部分はＤＮＡを鋳型として合成されるが、ｔＲＮＡ末端にある３つの塩基配列ＣＣＡだけはＣＣＡ付加酵素というＲＮＡ合成酵素によって合成される。この酵素は鋳型なしで塩基配列ＣＣＡを合成するユニークな酵素であるが、そのメカニズムは謎であった。
本研究は鋳型なしでＲＮＡ塩基配列を合成する酵素の全反応機構を世界ではじめて明らかにしたものである。これにより、鋳型なしで特定の塩基配列を合成できるＲＮＡ合成酵素の設計・開発、機能性タンパク質開発が可能になると期待される。
※添付資料１参照
本研究成果は、平成１８年１０月１５日に、英国科学誌 Ｎａｔｕｒｅ 電子版に掲載される。
研究の背景
ＤＮＡの遺伝情報はＲＮＡへ転写され、その後タンパク質へと翻訳される。長年ＲＮＡは単なるＤＮＡのコピーであり単に情報伝達の一時的ななかだちにすぎないと考えられてきた。しかしながら、近年ＲＮＡ 干渉等、ＲＮＡが生体において遺伝子発現の制御に積極的に関与していること、さらにその制御が高次生命現象の発現に深く関わっていることがあきらかになってきた。ＲＮＡの機能解析、機能性ＲＮＡ分子の生合成の機構解明は重要な課題となりつつある。
細胞内でタンパク質が合成される際において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）はアミノ酸の運び屋として働いているＲＮＡ１本鎖であり、常時３０種から４０種のｔＲＮＡが細胞内で働いている。全てのｔＲＮＡの３'末端にはＣＣＡという配列が存在し、その末端塩基Ａにアミノ酸が結合して、必要とされる場所にアミノ酸が運ばれる。ｔＲＮＡ本体の７０－９０塩基のＲＮＡ鎖はＤＮＡを鋳型として合成されるが、末端のＣＣＡ配列だけはＣＣＡ付加酵素とよばれる鋳型非依存性ＲＮＡ合成酵素によって合成される。
ＣＣＡ付加酵素は全生物に保存されている酵素であり、鋳型となるＤＮＡやＲＮＡなしできまった塩基配列を合成できるユニークな酵素である。これまで、鋳型非依存性ＲＮＡ合成酵素反応機構に関しては３０年以上謎であった。
研究の経緯
産総研は、生体内において機能をもったＲＮＡが生成されるまでのプロセス（成熟化プロセス）およびＲＮＡの品質管理システムの分子機構、機能と構造の相関に関する研究を推進している。
本研究では機能をもったｔＲＮＡの成熟化プロセスに関与する鋳型非依存性ＲＮＡ合成酵素の動的反応機構の全貌解明を目指して、Ｘ線結晶構造解析、生化学的解析の両方を用いて解析を行なった。
研究の内容
ＤＮＡやＲＮＡの鋳型を用いずにきまった塩基配列のＲＮＡを合成する酵素の分子基盤を明らかにすることを目指して、酵素とＲＮＡ鎖の会合、塩基単量体（ヌクレオチド）の会合、鎖伸長、終結反応に相当する酵素、ＲＮＡ鎖、ヌクレオチド複合体のＸ線結晶構造解析を行なった。
表に示すようにＣＣＡ酵素と４種類のＲＮＡ鎖の二者複合体、ＣＣＡ酵素と二種類のＲＮＡ鎖および塩基単量体の三者複合体、計６種類の複合体の構造決定を行なった。
※添付資料２参照
その結果（図１）、「酵素－ＲＮＡ鎖」の二者複合体（構造決定１、２）では、酵素は「開いた」構造をとっており、ＲＮＡ鎖の３'末端は酵素の活性触媒部位から離れているので仮に活性触媒部位へＣ塩基単量体がきても付加反応ができない「不活性型」であった。ところが、その二者複合体へＣ塩基単量体を加えた「酵素－ＲＮＡ鎖－Ｃ塩基単量体」の三者複合体（構造決定３）では、酵素は「開いた」構造から「閉じた」構造へと変化しており、それに伴い、ＲＮＡ鎖の３'末端が「ひっくり返り」Ｃ塩基単量体の付加反応が進行できるように酵素は「活性型」へ移行していた（図１［１］）。一方、最後のＡ塩基単量体の付加反応においては、「酵素－ＲＮＡ鎖－Ｃ－Ｃ」の二者複合体（構造決定４）ですでにＲＮＡ鎖の３'末端は活性触媒部位から近いところに位置し、酵素はすでに「閉じた」「活性型」の構造をとっていた。また、活性触媒部位のポケットの形と大きさはＡ塩基単量体に適したものになっており、Ａ塩基単量体がやってくればそのまま付加反応が進行する状態であることがわかった（図１［２］）。
図１ ［１］ 赤：構造解析２及び青：構造解析３
緑ＣＴＰ：Ｃ塩基単量体
［２］ 赤：構造解析４及び青：構造解析５
緑ＡＴＰ：Ａ塩基単量体
※添付資料３参照
これらの結果から、鋳型非依存性ＣＣＡ酵素の反応機構は次のように説明できる。
１）Ｃ塩基の付加反応においては酵素－ＲＮＡ鎖複合体に、Ｃ塩基単量体が酵素触媒部位に結合すると、酵素とＲＮＡの複合体の「動的」な変形が誘発され、ＲＮＡ鎖末端にＣ塩基単量体の付加が行われる。
２）最後のＡ塩基の付加反応においては、酵素にＲＮＡ鎖－Ｃ－Ｃのみが結合した「静的」な状態のままでＡ塩基の付加が行われ、反応が終結する、といったユニークな分子機構であることが明らかになった。
本研究は、鋳型非依存的なＲＮＡ合成反応の開始、鎖伸長、終結の際の酵素とＲＮＡ鎖の動的変化を世界ではじめて詳細に解明したものであり、この研究結果により、過去に詳細に研究されてきた鋳型依存性ＲＮＡ／ＤＮＡ合成酵素の動的反応機構と比較が可能になり、他の鋳型非依存性ＲＮＡ合成酵素の動的反応機構研究の基礎となるものである。これにより、鋳型を用いずに目的の配列をもったＲＮＡを合成する酵素開発が可能になる。また、非天然型アミノ酸の運び屋ｔＲＮＡの開発やそれに基づいた機能性タンパク質開発も期待され、医薬や新しい治療方法へ応用も期待される。
用語の説明
◆ｔＲＮＡ
転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ＲＮＡとよばれる７０－９０ヌクレオチドからなる低分子ＲＮＡであり、ｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）上の遺伝暗号であるコドンとアミノ酸とを結びつけるアダプター分子として働く。その３'末端にはＣＣＡ（シチジンーシチジンーアデノシン）配列が普遍的に存在し、その末端にアミノ酸が付加される。またこの配列は蛋白質合成工場であるリボゾームとの結合にも重要な役割を果たしている。［戻る］
◆３'末端
ＤＮＡあるいはＲＮＡ配列には方向性があり、ふたつある末端のうち始まりの末端を５'末端、終わりの末端を３'末端という。規則としてＲＮＡあるいはＤＮＡの配列を記載する時には５'末端から３'末端への配列を記載する。たとえば、ＡＣＴＧと記載されていれば５'末端はＡで、３'末端はＧである。［戻る］
◆ヌクレオチド
核酸の構成要素であり、糖と塩基がつながった構造をもつ。ＤＮＡの場合にはアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、ＲＮＡの場合にはアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のそれぞれ４種類からなる。［戻る］
◆鋳型依存性ＲＮＡ／ＤＮＡ合成酵素
生体内での核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）の合成に際し、通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成酵素は、合成する配列に相補的な核酸性の鋳型を必要とし、その鋳型の情報に従って定まった配列をもった核酸を合成する。たとえば、ＡＧＣＴという配列を合成するためにはＴＣＧＡといった相補的な配列をもった鋳型を必要とする（ＡとＴ、ＧとＣは相補的な関係にある）。しかしながら、このような核酸性の鋳型を用いない鋳型非依存性ＲＮＡ合成酵素が存在し、その分子メカニズムは長年未解決の問題であった。［戻る］
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