理化学研究所、ミトコンドリアＤＮＡ複製開始に遺伝的組換え開始と共通の装置が働くことを解明
ミトコンドリアＤＮＡ複製の常識の一端が覆る
－ ミトコンドリアＤＮＡ複製開始には遺伝的組換え開始と共通の装置がはたらく －
◇ポイント◇
・謎であった細胞質遺伝の基本問題（ホモプラスミー）を分子の機能で解く
・ＲＮＡの合成とされたミトコンドリアＤＮＡ複製開始と、細胞質遺伝の定説を書き換える
・神経や筋肉などの老化やミトコンドリア症対策について手掛かりに
独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）は、ミトコンドリアＤＮＡ※１複製の定説とされていた“ＲＮＡ合成”ではなく、複製開始配列でのＤＮＡ二本鎖切断などの遺伝的組換え開始と共通の反応が、子孫へ伝えられるミトコンドリアＤＮＡの複製で主要な働きをすることを、酵母を使って明らかにしました。この発見で、（１）しばしば変異して不均一になりがちなミトコンドリアＤＮＡが、全て同じ遺伝子組成を持つようにリセットされる仕組みと、（２）多くの遺伝子を失ったある種の変異ミトコンドリアＤＮＡが、極端な優先遺伝をする仕組みについて、分子の機能で合理的に初めて説明できました。これは、理研中央研究所柴田武彦上席研究員と凌 楓（りん ふぉん、ＬＩＮＧ Ｆｅｎｇ）先任研究員らの研究成果です。
ミトコンドリアは、生体の活動全てにエネルギーを供給する、細胞のエネルギー生産工場です。また、ミトコンドリアは、核とは別に独自のゲノムＤＮＡを持っており、いわゆる細胞質遺伝（非メンデル型遺伝）を行っています。個々の細胞には、数百から数千個以上ものミトコンドリアゲノムＤＮＡがあり、しばしば突然変異することから、このＤＮＡの組成はかなり不均一になると予測されます。また、歳をとると、一部の組織のミトコンドリアＤＮＡは不均一になっていきます。しかし奇妙なことに、増殖している個々の細胞や新生児では全身で、全てのミトコンドリアＤＮＡが同一の遺伝子型組成（同一のＤＮＡ配列）を持っています。この「ホモプラスミー」と呼ばれる状態へ短時間にリセットするという細胞質遺伝の現象は、酵母からヒトまで共通にみられます。このように何故、それぞれの細胞に数百から数千個もあるミトコンドリアＤＮＡ集団が均一になるように効率よくリセットされるかは長年の謎でした。さらに、ヒトでは、多くの遺伝子を失った変異ミトコンドリアＤＮＡが増加することによる不均一化は、神経などの老化や重篤な疾患と深く関わっていますが、その理由は分かっていませんでした。今回の発見は、こうした細胞質遺伝の謎を分子の働きで理解し、対策をたてるために、初めての手掛かりを得たと期待されます。
本研究成果は、米国微生物学会が出版する科学雑誌『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』に近く掲載されます。
１．背 景
ミトコンドリアは、細胞のエネルギー生産工場です。酸素呼吸によって生体の活動に必要なほぼ全てのエネルギーを供給しています。同時にミトコンドリアは、真核生物の祖先に寄生したバクテリアの子孫といわれ、その名残として核とは別に独自のゲノムＤＮＡを持っています。このミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が、母親からだけ遺伝する（母性遺伝）、いわゆる細胞質遺伝（非メンデル型遺伝）を行っています。
個々の細胞には、数百から数千個ものミトコンドリアゲノムＤＮＡがあります。ミトコンドリアの機能である酸素呼吸は副産物として活性酸素種を発生し、その結果、ミトコンドリアＤＮＡは、その作用でしばしば突然変異するため、このＤＮＡの組成はかなり不均一になると予測されます。歳をとると、神経や筋肉のミトコンドリアＤＮＡが不均一になり、歳とともに神経や運動の機能が衰える原因ではないかといわれています。しかし奇妙なことに、増殖している個々の細胞や新生児では全身において、全てのミトコンドリアＤＮＡが同一の遺伝子型組成（同一のＤＮＡ配列）を持っています。このようにミトコンドリアＤＮＡが均一になっている状態は、「ホモプラスミー」と呼ばれ、ミトコンドリアＤＮＡの基本状態です。ホモプラスミーへのリセットは、ヒトでは卵母細胞ができる過程の限られた時期に、また、酵母の場合には、十数回の細胞分裂の間で起こります。この細胞質遺伝の原則は、酵母からヒトまで共通となっています（図１）。
しかし、何故、ミトコンドリアＤＮＡ集団が効果的に均一になるようにリセットされるかは永年の謎でした。また、ヒトでは、多くの遺伝子を失った変異ミトコンドリアＤＮＡが増加することによる不均一化が、神経などの老化や重篤な疾患と深く関わっています。細胞集団の中で、ミトコンドリアＤＮＡの変異で呼吸の機能を失った細胞は、増殖にとって不利なはずで、本来ならば淘汰されるはずですが、それが器官の細胞集団で優性になってしまう理由は分かっていませんでした。
これらの現象には、ミトコンドリアＤＮＡ複製や複製したミトコンドリアＤＮＡが子孫へ分配することに関わっていると推定はされていました。ヒトでも酵母でも、ミトコンドリアＤＮＡには、特別なＤＮＡ複製開始配列があります。その配列部位の一方の端にある転写開始配列から合成されたＲＮＡの一部がそのまま、プライマー（合成・複製を始めるのに必要な断片）※２となりＤＮＡ複製が開始される、というのが教科書にも書かれている定説です（図２）。ところが、この定説では、それぞれのＤＮＡが複製していくことになり、不均一なミトコンドリアＤＮＡの集団が、ホモプラスミーという均一状態へリセットされる仕組みの説明が容易ではないという問題点がありました。
理研中央研究所の凌 楓 先任研究員と柴田 武彦 上席研究員は、これまでに、ミトコンドリアＤＮＡの組換えに必要なタンパク質“Ｍｈｒ１”の存在とその組換えや複製でのミトコンドリアＤＮＡへ対する働きを明らかにしています。具体的には、（１）タンパク質Ｍｈｒ１が、一本鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間で塩基配列がよく似たところを見つけ出して、分子間の二重鎖を作るという、普遍的な遺伝的組換え（相同ＤＮＡ組換えともいう）の開始反応（相同ＤＮＡ対合）を行なう、（２）Ｍｈｒ１はホモプラスミーへリセットするために必要である、（３）いくつもあるミトコンドリアＤＮＡの一つの環状ＤＮＡを鋳型にして起こる特殊な型のＤＮＡ複製（ローリングサークル型ＤＮＡ複製）によってできた単位長さのミトコンドリアＤＮＡがいくつも直列につながった多量体ＤＮＡ（コンカテマー）だけが選ばれて子供の細胞に伝わり、子供の細胞では、伝わって来た多量体ＤＮＡが、もとの環状型単量体に戻ります。その結果、急速に遺伝的に均一なＤＮＡ集団になることです（図３）。この成果から、この特殊な型のミトコンドリアＤＮＡ複製開始もまた、遺伝的組換えと同様に、ＤＮＡ二本鎖切断が働くのではないかと推定して、研究を進めました。
２．研究手法
酵母では、ヒトと違い、両親のミトコンドリアＤＮＡが子供に伝わるので、正常なミトコンドリアＤＮＡを持つ親と変異ミトコンドリアＤＮＡを持つ親との掛け合わせで、不均一なミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞を得ることが容易にできます。さらに、どちらのミトコンドリアＤＮＡが子孫に伝わるかを調べることもできます。正常なミトコンドリアＤＮＡを持つ親と特殊な変異ミトコンドリアＤＮＡを持つ親を掛け合わせるとその子孫が全て、呼吸能力を失ってしまうという、“超抑制的ミトコンドリアＤＮＡ”と呼ばれる変異ミトコンドリアＤＮＡがあります。この特殊な変異ミトコンドリアＤＮＡがどのように子孫へ伝わっていくかについて、上記の掛け合わせという遺伝学の手法で解析しました。
この遺伝学の実験と並行して、ＤＮＡ配列、細胞の中で、ＤＮＡ二本鎖切断が起こっているかどうか、その場所がどこか、細胞内でのミトコンドリアＤＮＡ分子種の状態を生化学的な手法で解析し、その結果と、遺伝学的な手法で得た結果とあわせて検討しました。
３．研究成果
酵母の「超抑制ミトコンドリアＤＮＡ」と呼ばれるものは、大規模な欠失変異によって正常型ミトコンドリアＤＮＡの数十分の一の部分だけからできており、正常型ＤＮＡが持つ複製開始配列のひとつを持つことが知られていました。すなわち、正常型に比べ、複製開始配列の密度を高め、正常型よりも速く複製するために超抑制現象※３が起こる、というのがこれまでの説明でした。
凌 楓 先任研究員、埼玉大学との連携大学院生 堀 晶子と柴田 武彦 上席研究員は、この超抑制ミトコンドリアＤＮＡを新たに得て解析したところ、超抑制ミトコンドリアＤＮＡ集団の一部で、その複製開始配列にＤＮＡ二本鎖切断が入っていることを見つけました。さらに、そのＤＮＡ二本鎖切断を入れる酵素は、酸化によってできたＤＮＡの傷を修復する系に働く、ＤＮＡ－Ｎ－グリコシダーゼ“Ｎｔｇ１”であることを明らかにしました。この、Ｎｔｇ１と先に見つけたミトコンドリアＤＮＡ組換えに働くＭｈｒ１の両方が、掛け合わせによってできた接合体で超抑制現象を引き起こすために必要であったことを明らかにしました（図４）。同時に、ミトコンドリアＤＮＡの単位がいくつも直列につながった多量体を効率的に合成するためには、Ｍｈｒ１に加えて、Ｎｔｇ１もまた必要なことがわかりました（図５）。また、意外なことに、試験管内で、単離したＮｔｇ１に細胞から単離したＤＮＡを反応させたところ、これだけで、ミトコンドリアＤＮＡの複製開始配列でＤＮＡ二本鎖切断が起こりました。ＤＮＡを抽出する前に細胞に酸化ストレスを与えるとさらに、ＤＮＡ二本鎖切断が多く入ったことから、ミトコンドリアＤＮＡ複製開始配列に特異的に起こる酸化損傷をＮｔｇ１が認識して、ＤＮＡ二本鎖切断を行うという可能性が支持されました。
以上をまとめると、酸化損傷に対して、ミトコンドリアＤＮＡの複製開始配列が特に高感受性で、この配列に酸化損傷が起こると、Ｎｔｇ１が働き、ＤＮＡ二本鎖切断が起こり、Ｍｈｒ１が、環状の別のミトコンドリアＤＮＡを相手に組換え過程を開始します。その結果できた組換え開始中間体でおこる、本来ならば限られた修復合成で終わるＤＮＡ合成がいつまでも続くことによって、直線状多量体（コンカテマー）ミトコンドリアＤＮＡが合成されるという全体像が描かれます。この全体像は、ホモプラスミーへのリセットをミトコンドリアＤＮＡ複製開始配列、Ｎｔｇ１の酸化損傷を認識してＤＮＡ二本鎖切断を行う機能とＭｈｒ１のＤＮＡ二本鎖切断端と環状ＤＮＡから組換えを開始する機能で説明できます（図６）。
さらに、正常型ミトコンドリアＤＮＡと超抑制ミトコンドリアＤＮＡを比較すると、同じ長さの多量体ＤＮＡに載る複製産物の個数は、超抑制ミトコンドリアＤＮＡの方が、数十倍多くなることから、超抑制現象を、複製開始配列の密度に加え、子孫へ送られるＤＮＡの複製産物の個数の違いで説明できました（図７）。このように、ミトコンドリアＤＮＡ複製開始配列に起こる特異的なＤＮＡ二本鎖切断とその切断に必要なタンパク質（Ｎｔｇ１）、ＤＮＡ二本鎖切断の後で遺伝的組換え反応に働くタンパク質（Ｍｈｒ１）が明らかになったことで、ミトコンドリアＤＮＡ遺伝のふたつの謎が解けました。
４．今後の期待
今回酵母で見つかったミトコンドリアＤＮＡ複製と子孫への伝達機構で、ヒトの細胞質遺伝と、変異ミトコンドリアＤＮＡ蓄積の機構が説明できます。しかし、その前に、再度、酵母とヒトのミトコンドリアＤＮＡの複製と子孫への伝達機構が共通であるかを改めて検証し、酵母で分かったことが、どこまで、ヒトに適応できるかを明らかにする必要があります。この検証を手掛かりにすると、現在、手の打ちようがないとされている高齢化にともなうミトコンドリアＤＮＡの変異蓄積やミトコンドリア症に対しても何らかの対策が見付かる可能性が出てきました。
＊補足説明などは、添付資料をご参照ください。