産総研、遺伝子を定量する技術「ＡＢＣ－ＬＡＭＰ法」を開発
■遺伝子の新規定量方法を開発
－簡便・正確・低コストの実現－
●ポイント
・ＤＮＡのグアニン塩基により蛍光が消光する特殊な蛍光色素を用いる。
・従来法では遺伝子（ＤＮＡ）増幅過程のリアルタイム計測が必要であったが、新規手法では増幅反応前後の蛍光変化を１度ずつ測定するだけでＯＫ。
・ヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析やインフルエンザウイルス等の定量的検出への応用展開を期待。
【 概 要 】
独立行政法人 産業技術総合研究所【理事長 吉川 弘之】（以下「産総研」という）生物機能工学研究部門【部門長 巌倉 正寛】バイオメジャー研究グループ【研究グループ長 関口 勇地】野田 尚宏 研究員は、早稲田大学【総長 白井 克彦】理工学術院 常田 聡 教授、早稲田大学大学院 谷 英典、株式会社 Ｊ－Ｂｉｏ２１【代表取締役社長 児玉 俊史】取締役技術部長 蔵田 信也らとともに、簡便・正確・低コストでＤＮＡを定量する新技術（ＡＢＣ－ＬＡＭＰ法）を開発した。
ＤＮＡを定量する技術は、ヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析、ＳＡＲＳや鳥インフルエンザウイルス等に代表される国民生活を脅かすウイルスの検出・定量や、組換え大豆等に代表される遺伝子組換え食品の混入率検査などに利用されており、社会的必要性は高い。
今回開発した技術は、ＤＮＡのグアニン塩基との相互作用により蛍光が消光する色素で標識したプローブ（ＡＢ－ＱＰｒｏｂｅ）と、既知濃度の内部標準用ＤＮＡを組み合わせることにより、正確なＤＮＡ定量を実現した。ＤＮＡ増幅反応前後で１回ずつ蛍光を測定するだけで、標的ＤＮＡの定量が可能なためＤＮＡ定量を簡便かつ低コストに達成できる（図１）。従来技術と比較した場合の本技術の長所は以下の点である：１）蛍光増幅過程をリアルタイムで計測する必要がない、２）ゲル電気泳動が不要、３）高価なリアルタイムＰＣＲ装置が不要、４）ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質の影響を受けにくい。
本技術の詳細は米国化学会Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌電子版に近日中に発表される。
図１ 新技術ＡＢＣ－ＬＡＭＰ法の概要と従来法との比較
※ 関連資料参照
【 開発の社会的背景 】
遺伝子（ＤＮＡ）を定量する技術は、ヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析ＳＡＲＳや鳥インフルエンザウイルス等に代表される国民生活を脅かすウイルスの検出・定量や組換え大豆等に代表される遺伝子組換え食品の混入率検査などに利用されており、社会的必要性の高い技術である。
これまで、微生物や動植物に含まれるＤＮＡの定量には定量的ＰＣＲ法の一つであるリアルタイムＰＣＲ法が用いられてきた。リアルタイムＰＣＲ法はＰＣＲによりＤＮＡ増幅を行い、その増幅産物量をＰＣＲの１サイクルごとに測定することで標的のＤＮＡを定量する手法である。増幅産物量の蛍光を１サイクルごとに測定する必要があるため、１）蛍光測定装置とＰＣＲ用サーマルサイクラーが一体となった高価なリアルタイムＰＣＲ装置が必要、２）ハイスループット化（高速大量処理）に限界がある、３）ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質が存在した場合、定量値を過少評価してしまう、等の問題点があった。
上記の問題を克服した簡便・低コスト・ハイスループット・正確なＤＮＡ定量法はライフサイエンス分野のみならず、環境・農業・食品分野などさまざまな分野で開発が望まれている。
【 研究の経緯 】
産総研は簡便・低コスト・ハイスループット・正確なＤＮＡ定量技術の開発を推進してきており、産総研と早稲田大学と株式会社Ｊ－Ｂｉｏ２１は蛍光消光現象を利用した新規ＤＮＡ定量技術の開発に取り組んできた。その過程で、グアニン塩基との特異的な相互作用により蛍光が消光する蛍光色素と、独自に考案した遺伝子配列をもつ本手法に特化した内部標準用ＤＮＡを用いることで新規ＤＮＡ定量法の開発に成功した。
なお、本研究は、独立行政法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構の平成１８年度産業技術研究助成事業による支援を受けて行ったものである。
【 研究の内容 】
新技術はグアニン塩基との特異的な相互作用により蛍光が消光する色素で標識したプローブ（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ： ＡＢ－ＱＰｒｏｂｅ）と内部標準用ＤＮＡを用いる。これにより遺伝子増幅反応の前後で蛍光を測定するだけで標的ＤＮＡを定量することができる（図１）。新技術は以下のような４つの特徴を持つ、１）リアルタイムＰＣＲ法のように蛍光をＰＣＲの１サイクルごとに測定する必要がない、２）ゲル電気泳動が不要、３）高価なリアルタイムＰＣＲ装置が不要、４）ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質の影響を受けにくく、正確な定量が可能。
さらに、本研究では上記ＡＢ－ＱＰｒｏｂｅと内部標準用ＤＮＡを用いた技術を、既に開発されている等温ＤＮＡ増幅法ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と組み合わせることで簡便・正確・低コストのＤＮＡ定量法（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ－ＬＡＭＰ： ＡＢＣ－ＬＡＭＰ）を開発した。
本技術では、測定しようとする標的ＤＮＡと内部標準用ＤＮＡ及びＡＢ－ＱＰｒｏｂｅを用いて標的ＤＮＡの定量をおこなう。ＡＢ－ＱＰｒｏｂｅの末端には蛍光標識Ｃ塩基があるので、標的ＤＮＡのＧ塩基に出会うと消光する。一方内部標準用ＤＮＡは標的ＤＮＡと同じ効率で増幅されるが、その増幅産物に結合したプローブの蛍光は消光されないように、相補部分（プローブが結合する部分）の末端をＧ塩基ではなくＣ塩基としたＤＮＡ鎖を人工合成し、内部標準用ＤＮＡとする。ＡＢ－ＱＰｒｏｂｅは標的ＤＮＡと内部標準用ＤＮＡ由来の増幅産物に同じ結合力で競合的に結合するが、どちらに結合したかによって蛍光消光の強さが変わる（図２）。この消光強度の違いを利用して、ＬＡＭＰ反応前後に蛍光を測定することで標的ＤＮＡの定量を行うことができる（図３）。
図２ Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅの消光パターンの概要
※ 関連資料参照
図３ ＡＢＣ－ＬＡＭＰ法による遺伝子定量の概要
※ 関連資料参照
ＤＮＡ増幅法としては本研究で用いたＬＡＭＰ法以外にもすでに幅広く利用されているＰＣＲ法があり、さらにはＲＮＡを特異的に増幅するＮＡＳＢＡ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法なども開発・利用されているが、本技術は反応前後での蛍光測定により標的ＤＮＡ（ＮＡＳＢＡ法の場合はＲＮＡ）の定量を行うため、これらの増幅法とも容易に組み合わせることが可能であり、さらなる発展が期待される。
本技術を用いてアンモニア酸化細菌のアンモニア酸化酵素をコードする遺伝子の一部を定量した結果、本技術は従来法と同等の精度・再現性を持つことがわかった。また、従来法ではＤＮＡ増幅反応を阻害するフミン酸および尿素の濃度が増加するにつれ真値よりも低い値を示したが、本技術ではフミン酸および尿素の濃度のいずれにも依存せず正確に標的ＤＮＡを定量することができた。
【 今後の予定 】
本技術をヒトの病気診断等を目的とした遺伝子発現解析やＳＡＲＳ、鳥インフルエンザウイルス等の定量的検出に応用することを目指す。
産総研認定ベンチャーである株式会社 Ｊ－Ｂｉｏ２１では本手法に最適化された安価な蛍光測定装置を開発中である。
【 用語の説明 】
◆ＬＡＭＰ法
Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法の略名。 ６種あるいは４種のプライマーを用いるＤＮＡ増幅法であり、１）反応温度が一定でかつ穏和、２）増幅産物の分子量が大きいなどの特徴を持つ。栄研化学株式会社が開発したＤＮＡ増幅法である。
◆塩基
核酸を構成する成分である複素環式化合物。アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の３種はＤＮＡにもＲＮＡにも含まれるが，チミン（Ｔ）はＤＮＡにのみ、ウラシル（Ｕ）はＲＮＡにのみ存在する。塩基に糖（ＤＮＡではデオキシリボース、ＲＮＡについてはリボース）が付加されたものをヌクレオシド、さらにリン酸が付いたものをヌクレオチドと呼ぶ。
◆内部標準用ＤＮＡ
標的ＤＮＡが増幅される時に同時に増幅される人工的に合成されたＤＮＡ鎖。標的ＤＮＡと長さは等しいが内部配列が若干異なる。未知濃度の標的ＤＮＡを含む反応溶液に既知濃度の内部標準用ＤＮＡを加えて増幅反応を行い、蛍光強度を測定することで、標的ＤＮＡの濃度を求めることができる。
◆リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲとは、遺伝子の特定の部分を複製する反応を繰り返し行う操作をいう。ＰＣＲでは、複製する部分が元の試料中に多く含まれていると、少ない複製回数で多量の複製産物が得られるが、試料中に少ししか含まれていなければ、複製回数を多くしないと多量の複製産物は得られない。この関係を利用して、複製産物が一定量にまで増えるのに、何回の複製反応を要したかを調べて、元の試料中の特定の遺伝子の存在量を定量するのがリアルタイムＰＣＲ法である。リアルタイムＰＣＲ法ではＤＮＡ増幅装置と分光蛍光光度計を一体化した機器を用い、ＰＣＲでの増幅産物の生成の過程を蛍光値の増加などでリアルタイムに検出し、解析することで目的とするＤＮＡの定量を行う。
◆ＮＡＳＢＡ法
ＮＡＳＢＡ法は、転写反応を利用したＲＮＡ特異的な定温核酸増幅法である。４１℃の一定温度下、１チューブ内で３種類の酵素と鋳型特異的な２種プライマーの共同作用により、ゲノムＤＮＡの影響を受けることなく鋳型ＲＮＡに相補的な１本鎖アンチセンスＲＮＡが増幅産物として得られる。
◆アンモニア酸化細菌
好気的条件下でアンモニアを亜硝酸へ酸化する微生物。
◆フミン酸
植物などが微生物により分解される最終生成物であるフミン質のうち、酸性である無定形高分子物質。腐食酸とも言う。土壌などに多く含まれ、ＰＣＲなどを阻害することが知られている。
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